PCR是如何工作的?
聚合酶链反应需要两种试剂,DNA聚合酶和引物,以及热循环过程。这些成分使链式反应成为可能,链式反应以指数方式复制起始DNA样本。
DNA聚合酶是一种从脱氧核糖核酸合成分子的酶,脱氧核糖核酸是DNA的基石,为了从一个原始DNA片段生成两个相同的DNA片段。
聚合酶是PCR中通常使用的特定酶,因为它可以承受热循环的极端温度变化,无需在每个PCR循环后添加新的、不稳定温度的DNA聚合酶。它的来源是细菌水生栖热菌在PCR被发现时,它首先从黄石国家公园的地热泉中分离出来。
底漆是单链DNA的短片段,必须对其进行专门设计,以促使DNA聚合酶启动目标DNA片段的扩增。
热循环指的是促进DNA扩增的温度依赖反应的反复加热和冷却循环。一个热循环器是一种实验室仪器,用于进行温度依赖的化学反应,包括PCR。
PCR的一个周期使开始时的DNA数量加倍。每个循环包括三个步骤:变性、退火和延伸。
- 变性
PCR循环的第一步是将起始样品加热至几乎沸腾。高温导致DNA熔化,或变性——物理上破坏DNA双螺旋两条互补链之间氢键的过程。其结果是两条DNA单链随后将被合成成两个完整的DNA双螺旋。
- 退火
变性后,样品的温度降低。这使得引物能够与每条分离的DNA链上的互补序列结合。引物为Taq聚合酶在最后一步开始DNA形成奠定了基础。
- 扩大
在最后一步中,将样品重新加热至Taq聚合酶最活跃的温度(约162°F(72°C)),以便酶可以在退火阶段固定在引物产生的碱基上。Taq聚合酶从原始DNA片段组装两个完整的DNA片段。
然后,一个新的PCR周期准备开始,DNA量是前一周期的两倍。循环继续,直到达到所需数量的DNA。